CRISPR Gene Editing
CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）基因编辑技术可实现基因靶向编辑与表达调控，可应用于多种生物体系；该技术源自细菌适应性免疫体系中的 CRISPR-Cas9 系统。R&D Systems 提供一系列抗体、小分子及蛋白产品，以支持 CRISPR 基因编辑实验研究。
CRISPR Cas9 抗体套装
配套验证成熟的专用抗体，可精准检测 CRISPR-Cas 蛋白，适配多种应用场景。
单细胞分选设备
借助 Bio-Techne 旗下 Hana™、Pala™ 单细胞分选仪，可快速温和筛选、分离经荧光标记的 CRISPR 基因编辑细胞。
脂质纳米颗粒原料
提供高品质脂质原料，可制备脂质纳米颗粒，用于递送 CRISPR-Cas9 等各类基因编辑载体。
CRISPR-Cas9 基因编辑工作流程
一、基因递送
可通过多种方式将 CRISPR DNA、RNA、RNP 导入细胞，常用手段包含脂质纳米颗粒递送、病毒和慢病毒载体转染，以及电转染法。
Bio-Techne 提供一系列用于 CRISPR 递送的试剂：
基因转染效率
借助CRISPR-Cas9 专用抗体，可验证基因递送是否成功。对比转染组与空载转染组细胞中 Cas9 表达水平，是评估转染效率的关键手段。利用 CRISPR-Cas9 抗体，可通过蛋白免疫印迹、免疫染色等技术验证转染效率。
CRISPR 介导的基因编辑通常效率不高；可使用小分子CRISPR 增强剂提升编辑效率。
采用 PEI STAR™ 转染试剂与竞品 PEI 试剂分别将 CMV-SEAP 质粒转染至 HEK293 细胞悬液中，检测吸光度数值。PEI STAR™ 转染试剂(货号 7854)实验性能数据对比（HEK293细胞）：配制 20 mL HEK293 细胞悬液培养体系，以优化的 PEI/DNA 比例，分别使用 PEI STAR™（3:1）和主流竞品 PEI 转染 CMV-SEAP 质粒。转染 5 天后，采用磷酸酶报告染料及紫外/可见光吸光度法对 SEAP 表达水平进行定量检测。
二、CRISPR-Cas9 蛋白检测
CRISPR-Cas9 检测包含蛋白量表达分析以及细胞内定位分析两大方向,均可使用 CRISPR-Cas9 特异性抗体完成检测。
CRISPR-Cas9 蛋白表达调控
Cas9 蛋白的表达水平及表达时长对 CRISPR-Cas9 基因组编辑至关重要。构建稳定表达细胞株时，Cas9 过高表达易引发非特异性切割作用。可通过筛选多株单克隆细胞株，结合蛋白免疫印迹实验筛选出 Cas9 表达水平适宜的细胞株，以此规避该问题。瞬时转染实验中，Cas9 蛋白持续长时间表达会大幅增加脱靶突变的发生概率。可在不同时间点收集转染后的实验样本，通过蛋白免疫印迹实验检测 CRISPR-Cas9 蛋白的瞬时表达特性。
亚细胞定位
CRISPR-Cas9 必须进入转染细胞的细胞核内，才能对 DNA 发挥编辑作用。可采用 CRISPR-Cas9 特异性抗体，通过 ICC/IF、IHC染色，验证 Cas9 蛋白是否定位于细胞核内。
HEK293 细胞中的 CRISPR-Cas9 蛋白表达实验。 实验所用载体融合表达化脓性链球菌 CRISPR-Cas9 N 端 608 个氨基酸与 GFP，将其转染至 HEK293 细胞，并以 兔抗 CRISPR-Cas9 多克隆抗体 （红色；货号 NBP3-05548）进行染色。转染细胞可表达绿色融合蛋白，同时与红色荧光抗体结合，最终呈现黄色荧光信号。实验采用蓝色 DNA 染料 DAPI对转染与未转染细胞的细胞核 DNA 进行染色定位。
三、基因编辑结果验证
确认靶细胞基因编辑是否成功，是 CRISPR-Cas9 基因编辑工作流程中的重要步骤。可通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）在信使 RNA 水平验证编辑效果，也可使用经验证的基因敲除（KO）型抗体在基因层面完成验证。了解更多 CRISPR/Cas9 基因敲除细胞裂解液相关信息
按应用分类的基因敲除验证抗体
| ICC/IF基因敲除验证抗体 | 蛋白免疫印迹基因敲除验证抗体 | Simple Western基因敲除验证抗体 |
分别对 K562 亲本细胞系及波形蛋白基因敲除（KO）K562 细胞系中的波形蛋白表达水平开展蛋白免疫印迹检测。实验上样浓度统一为 0.2 mg/mL，取用两种细胞的蛋白裂解液进行电泳转膜。一抗选用 山羊抗人/小鼠/大鼠波形蛋白抗原亲和纯化多克隆抗体 (货号 AF2105)，二抗采用 HRP 偶联抗山羊 IgG 二抗（货号 HAF017）完成孵育显色。在 K562 亲本细胞系中，于约 55 kDa 处（如图示）检测到波形蛋白特异性条带，但在波形蛋白敲除 K562 细胞系中未检出。实验以 GAPDH（货号AF5718）作为上样内参。
Milo 单细胞蛋白免疫印迹系统
依托 Milo 单细胞蛋白免疫印迹技术，只需少量细胞即可分析 CRISPR 基因编辑效率及蛋白表达均一性。
RNAscope 原位杂交检测试剂盒
Bio‑Techne 旗下 Advanced Cell Diagnostics 品牌推出的 RNAscope 原位杂交技术可实现单细胞水平 RNA 的可视化和空间定位检测，并包含适用于 CRISPR-Cas9 检测的 Cas9 探针。
非病毒基因工程
利用 TcBuster™ 系统递送目的基因，充分释放基因编辑应用潜力。TcBuster 是一种非病毒转座子系统，可实现稳定的基因递送，快速构建转基因细胞。
蛋白免疫印迹
蛋白免疫印迹分步式实验指南，帮助理解该经典技术原理，掌握获得可靠且可重现结果的实验操作方法。
图 1：CRISPR-Cas 系统结构示意图。
CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）是一种可实现基因靶向编辑与表达调控的技术，可应用于多种生物体系。
CRISPR-Cas9 是一种 RNA 引导的 DNA 核酸内切酶（分子量：158.4 kDa），该蛋白源自细菌获得性免疫机制，用于抵御侵入的质粒和病毒。 CRISPR 基因座由Cas（CRISPR 关联）基因、前导序列及重复间隔阵列（CRISPR 重复序列）共同构成。Cas 基因编码具备 DNA 切割活性的核酸酶。在 II 型 CRISPR 系统中，Cas1/2 蛋白识别入侵外源 DNA，并将其片段作为原间隔序列，插入细胞 CRISPR 重复序列之间。CRISPR 阵列随后转录形成 crRNA，crRNA 与反式激活（tra）crRNA 及 Cas9 蛋白形成复合体。crRNA 的原间隔序列区域与入侵 DNA 的互补序列特异性结合，再由 Cas9 完成 DNA 剪切。
科研人员改造天然 CRISPR 系统，开发出可在基因组特定位点进行靶向基因编辑的技术。通过产生 DNA 双链断裂，CRISPR-Cas9 技术可用于在任意目标基因组位点诱导插入或缺失突变、特异性序列替换或插入，以及大片段缺失或基因组重排。
该功能依靠人工设计 RNA 引导核酸酶实现。在最简单的形式中，Cas9 与向导 RNA（gRNA）结合，该向导 RNA 由 crRNA 和 tracrRNA 组成。gRNA 含有与目标 DNA 序列互补的序列，因此能将 Cas9 引导至基因组特定位点。随后，Cas9 对 DNA 进行切割，形成双链断裂。
DNA 双链断裂可通过内源性非同源末端连接（NHEJ）与同源定向修复（HDR）两种机制进行修复。通过 NHEJ 途径进行的 CRISPR-Cas9 基因组编辑精度较低，但编辑效率可达 20-60%；而通过 HDR 实现的基因编辑虽然更为精准，但效率仅为 0.5-20%。相较于 NHEJ，HDR 具有更高的精准度，因此提高 HDR 的效率对 CRISPR-Cas9 系统的各类应用至关重要。
近期研究表明，小分子能够提高 HDR 介导的基因编辑效率。β3 肾上腺素能受体部分激动剂L-755,507已被证实在多能干细胞中可将 HDR 介导的 GFP 插入效率和点突变编辑效率分别提升 3 倍和 9 倍。小分子SCR7 pyrazine也被证实可提升 HDR 效率，可将短 DNA 片段的插入效率提高多达 19 倍。这类能够提升 HDR 效率的小分子，已成为 CRISPR-cas9 基因编辑体系应用中的重要配套工具。
人类 Ki-67/MKI67 基因敲除（KO）抗体的免疫细胞化学验证
国际抗体验证工作组将遗传阴性对照列为确保抗体特异性的五项关键标准之一。抗体与靶标相互作用的特异性、选择性和保真度通常因具体分析应用（如免疫印迹与免疫染色）的复杂性而异。双等位基因敲除细胞裂解液 (适用于蛋白免疫印迹)和双基因敲除细胞系（适用于免疫细胞化学）是快速、可靠地验证抗体对靶标特异性的最佳阴性对照，可有效确保实验结果的重现性。
利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术制备基因敲除细胞裂解液和细胞系，为验证抗体特异性及阐明基因功能提供了可靠的工具支持。例如在蛋白免疫印迹分析中，仅凭在预期分子量位置出现单一条带，只能初步判断抗体特异性；规范的抗体验证必须搭配合适对照体系。由于 CRISPR/Cas9 基因编辑技术能够完全移除或“敲除”编码目标蛋白基因的两个等位基因，因此在蛋白免疫印迹实验中，若仅野生型细胞裂解液中出现目的蛋白条带，而基因敲除细胞裂解液中无对应条带，即可明确验证抗体的特异性。
注：若要准确判定差异表达，还需单独检测另一种蛋白作为上样内参（例如 GAPDH），用以证明所有泳道的样品上样量与转膜效果保持均一、无实验偏差。