什么是 ELISA？ELISA 有哪些不同类型？

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ELISA：酶联免疫吸附试验

ELISA 是一种免疫分析方法，常用于定量检测样本中特定靶标物质的含量。ELISA 实验中常用的样本包括血清、血浆、细胞培养上清液、细胞裂解液、唾液、组织裂解液和尿液。

ELISA 实验通常在包被特异性捕获抗体的 96 孔微孔板中进行。加入实验样本、标准品或对照品孵育后，靶标分析物被板上捕获抗体结合固定。再加入结合靶标分析物上不同表位的偶联检测抗体，完成夹心结构。随后加入底物溶液，生成的显色信号强度与结合的分析物含量成正比。ELISA可以有不同形式。

ELISA 类型

ELISA 的四种主要类型：

直接法 | 间接法 | 夹心法 | 竞争法

每种 ELISA 方法均有其自身的优劣之处。

直接法 ELISA

在直接法 ELISA 中，抗原或待测样本直接固定于微孔板，再加入偶联检测抗体结合靶标蛋白。随后加入底物，生成的显色信号强度与样本中分析物含量成正比。由于直接法 ELISA 中仅使用单一抗体，其特异性低于夹心法 ELISA。

适用场景：评估抗体亲和力与特异性。研究阻断/抑制性互作关系。

优势：

  • 操作简便、实验耗时短

缺点：

  • 仅使用 1 种抗体，特异性较低。
  • 如果样本中的所有蛋白均被固定在孔中，可能导致较高的背景信号。
Diagram of a direct ELISA

间接法 ELISA

间接法 ELISA 与直接法 ELISA 类似，都需要将抗原固定在微孔板上，但前者包含额外的放大检测步骤。先加入未偶联一抗，该抗体特异性结合板上抗原。然后，加入针对一抗宿主物种的偶联二抗。随后加入底物，生成的显色信号强度与孔内结合的抗原量成正比。

适用场景：检测机体内源性抗体。

优势：

  • 使用二抗进行信号放大，灵敏度更高

缺点：

  • 二抗易发生非特异性交叉反应
Diagram of an indirect ELISA

夹心法 ELISA

夹心法 ELISA 是应用最广泛的 ELISA 类型。采用两种特异性抗体从两侧“夹心包裹”抗原，通常称为配对抗体。捕获抗体包被在微孔板上，加入样本后，靶标蛋白被捕获固定。然后，加入偶联检测抗体，该抗体将与靶标蛋白上的另一个表位结合。加入底物，生成的显色信号与样本中分析物含量成正比。夹心法 ELISA 具有极高的特异性，因为需要两种抗体双重识别靶标蛋白。

适用场景：测定生物样本中的分析物浓度

优势：

  • 特异性、灵敏度最高
  • 可用于复杂基质样本

缺点：

  • 实验流程偏长
  • 方法开发难度高
Diagram of a sandwich ELISA

竞争法 ELISA

竞争法 ELISA 常用于小分子检测，当靶标蛋白分子量过小、难以用两种抗体高效夹心捕获时尤为适用。与夹心法 ELISA 类似，在微孔板上包被捕获抗体。不使用偶联检测抗体，本方法采用偶联抗原与样本内源抗原竞争结合位点。样本中待测抗原含量越高，结合至捕获抗体的偶联抗原就越少。加入底物，生成的显色信号与样本中蛋白含量成反比。

适用场景：测定小分子、激素类物质浓度。

优势：

  • 能够定量分析小分子

缺点：

  • 仅使用 1 种抗体，特异性较低。
  • 需要偶联标记抗原
Diagram of a competitive ELISA

直接法与间接法 ELISA 如何选择？

直接法 ELISA 与间接法 ELISA 的区别在于 ELISA 板上固定抗原的检测方法。直接法 ELISA 采用偶联一抗，而间接法 ELISA 则包含额外的信号放大步骤。在间接法 ELISA 中，未偶联一抗与抗原结合，再用针对一抗宿主物种的标记二抗结合一抗。由于信号放大步骤，间接法 ELISA 检测灵敏度通常优于直接法 ELISA，但二抗易与样本抗原发生交叉反应，导致背景信号升高；额外的孵育步骤也会拉长整体实验时长。使用间接检测的优势在于，同一款二抗可用于多种不同检测体系，无需为每次 ELISA 试验单独偶联标记一抗。

相较其他技术，为何选用 ELISA？

目前有多种不同的免疫分析平台可用于测定生物体液中的蛋白含量。ELISA 方法因具备优异的灵敏度、特异性、准确度，且耐受严苛缓冲液、预处理条件，成为多数场景首选方案。与蛋白免疫印迹相比，夹心法 ELISA 采用两种特异性抗体识别靶标，可实现完全定量的检测结果；而蛋白免疫印迹易出现非特异性条带，且最多仅为半定量分析。ELISA 相较于其他多重检测平台的一大优势在于，能够针对特定抗原定制检测方法，且无需兼顾众多其他抗体、蛋白的兼容匹配，大幅降低交叉反应、基质干扰风险，便于不断突破检测灵敏度上限。

ELISA 检测灵敏度出众的原因？

依托抗体特异性结合以及多样化信号放大或读取系统，ELISA是灵敏度顶尖的免疫检测方法。  针对超低丰度蛋白，还可灵活调整上样体积提升检出率。  如上所述，间接法 ELISA 依靠二抗结合实现信号放大。 高灵敏度 ELISA 试剂盒额外增设信号放大体系进一步提高检测灵敏度，  这常用放大系统包括 碱性磷酸酶 、链霉亲和素-HPR 聚合物。

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