细胞自噬
自噬是一种保守的细胞过程,在此过程中,双膜囊泡或自噬小体指向长寿蛋白、蛋白聚集体以及多余或受损的细胞器目标,并予以清除。基础自噬活性存在于所有细胞中,发挥稳态作用,使细胞能够将基本分子成分(氨基酸)用作构建单元或能量来源。
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自噬诱导剂和抑制剂
能够抑制或诱导自噬活性的小分子为调节和研究自噬提供了重要机制。自噬可在体内和体外诱导,因此研究人员能够在从单细胞到整个有机体的不同层面上开展自噬研究。诱导自噬最可靠的一种方法是使用自噬诱导肽Tat-Beclin 1 D11(Tat-D11)和Tat-Beclin 1 L11(Tat-L11)。欢迎访问自噬诱导肽专题 页面,深入了解关于这些高特异性肽的详细信息。
巨自噬
巨自噬的过程是将胞质中的成分包裹在一种称为自噬体的双层膜细胞器中,将其转运至溶酶体,随后降解其中的底物。此后,巨自噬简称为自噬。
自噬可以通过两种方式发生:一种是非选择性(批量)降解,另一种是选择性清除胞质中的特定成分,包括病原体、蛋白聚集体和功能失调的细胞器。为维持自身功能,许多细胞器都具有特定的自噬通路,例如线粒体自噬(针对线粒体)、内质网自噬(针对内质网)、过氧化物酶体自噬(针对过氧化物酶体)以及溶酶体自噬(针对溶酶体)。
自噬过程可分为以下步骤:诱导、成核与吞噬泡形成、延伸与自噬体形成、与溶酶体融合形成自噬溶酶体,以及降解。在初始阶段,ULK1发生去磷酸化,导致ULK1/ATG13/ATG101复合物的活性增加,进而诱导自噬。自噬相关(ATG)蛋白质及复合物在上述多个步骤中非常重要,多种ATG蛋白在自噬体的延伸与形成过程中尤为关键。简而言之,ATG7介导ATG5-ATG12-ATG16L1复合物的形成,与ATG4和ATG3协同,将pro-LC3加工为与磷脂酰乙醇胺(PE)脂质结合的LC3-II形式,后者和自噬体膜结合。
微自噬
微自噬是指溶酶体在自噬体未形成的情况下,通过膜内陷或外凸直接吞噬细胞质成分的过程。装载有底物的液泡从膜上分离,随后被内化进入溶酶体,成为微自噬体。与巨自噬的过程相似,微自噬体也会裂解,其中的内容物被液泡水解酶降解为可循环利用的大分子。
分子伴侣介导的自噬
分子伴侣介导的自噬(CMA)与其他两种类型自噬的区别在于,该过程不涉及自噬体的生成。与微自噬类似,CMA同样不依赖自噬体即可发生,但不同的是,CMA不涉及溶酶体膜内陷。相反,伴侣蛋白(如热休克同源70蛋白;HSC70)能够识别胞质中带有KFERQ样基序的底物,这些底物由此被标记为待降解。这种分子伴侣与底物形成的复合物会与位于膜上的溶酶体相关膜蛋白 2A(LAMP-2A)相结合,促使折叠的胞质蛋白转运进溶酶体。
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自噬检测方法
传统意义上,自噬过程主要是通过使用电子显微镜研究的。ATG蛋白的发现与表征推动了用于识别和定量分析自噬活性的分子工具及方法的发展。理想情况下,应综合运用多种方法(针对评估自噬活性实施稳态测量和通量测量)评估自噬活性。
稳态分析:自噬体数量
检测自噬体数量或含量时,通常都以LC3蛋白为检测靶点。可在胞质和核区发现LC3。脂化形式的LC3-II是目前已知唯一和自噬体内膜结合的蛋白质。通过免疫荧光(ICC/IHC/IF)和免疫检测(WB)检测到的LC3-II水平,可用于针对自噬体数量进行良好的估计。
监测自噬通量
自噬通量是指底物被完全处理的流程,包括最初的隔离,后续的降解,以及最终将基本组分回收至细胞质。在免疫荧光或免疫印迹检测中,LC3-II信号的增强可能是自噬活性增加增强引起的。然而,LC3-II含量增加或自噬体数量增多也可能是自噬通量阻断引起的。因此,为明确区分上述机制,需要联合使用测量自噬通量的检测方法与稳态检测方法。
检测方法 | 方法 | 活性 | 方案与资源 |
|---|---|---|---|
| LC3-II 斑点 | ICC/IHC/IF | 自噬体数量 | LC3B/MAP1LC3B抗体(NB100-2220)免疫组织化学-石蜡方案 |
| LC3 转化 | WB | 自噬体数量 | LC3/MAPILC3A抗体套装 (NB910-40752) |
| LC3 转换检测 | WB, ICC/IF | 自噬通量 | 自噬抑制与LC3B抗体(NB100-2220)蛋白免疫印迹分析 |
| p62/SQSTM1 降解检测 | WB、流式细胞术、ELISA、ICC/IF | 自噬通量 | p62/SQSMT1抗体(NBP1-48320)的蛋白免疫印迹分析方案 |
| mTOR | WB、IP、激酶检测 | 自噬体数量/自噬通量 | mTOR交互式通路 |
| AMPK | |||
| ATG1/ULK1 | |||
| ATG12 | ICC/IF | 自噬体数量/自噬通量 | |
| ATG5 | ATG5抗体(NB110-53818)的蛋白免疫印迹法方案 | ||
| ATG16L1 | ATG5抗体(NB110-53818)的蛋白免疫印迹法方案 | ||
| 内源性 WIPI1 | |||
| 内源性 WIPI2 |
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